大球盖菇菌种生产方法和蘑菇、草菇菌种生产方法基本相同，可用组织分离法和孢子分离法获得纯菌种，新区主要靠引进母种或原种。适合大球盖菇母种生产地培养基和原种培养料如下：
一、母种培养基
1、麦芽糖酵母琼脂培养基大豆蛋白胨（豆胨）1克、酵母2克、麦芽糖20克、琼脂20克，加水至1000毫升。
2、马铃薯葡萄酵母琼脂培养基马铃薯300克（加水1500毫升，煮20分钟，滤汁）、酵母2克、豆胨1克、葡萄糖10克、琼脂20克，加水至1000毫升。
3、燕麦粉麦芽糖酵母琼脂培养基燕麦粉80克、麦芽糖10克、酵母2克、琼脂20克，加水至1000毫升。
上述3种配方中如不加琼脂，即可作为液体培养基。以上培养基需按常规配制、分装、灭菌、接种和培养。
二、原种和栽种培养种培养料
1、将小麦秆或裸麦秆，切碎（长2—3厘米），泡湿，装瓶，高压灭菌后备用。
2、小麦、裸麦、高粱、玉米、小米等谷粒浸泡，煮透至没有白芯但表皮不破，加2%碳酸钙，装瓶，高压灭菌后备用。
3、用细木屑和小木片各40%、麸皮20%，创作栽种培养种培养料基。
还可用培养3—4天地液体菌种接种。若用固体菌种必须加大接种量（菌种/培养料），接种量最少10%，最好15%—20%。
4、培养。接种后，把菌种瓶或袋放在20℃—28℃培养室中培养。大球盖菇菌丝生长几天后，菌丝生长速度会逐渐缓慢，加速菌丝生长地方法是搅拌。用液体菌种接种地无菌麦粒培养基，每隔3—7天摇瓶1次，把菌丝摇断，可以刺激菌丝再生，能保证菌丝生长旺盛。
